师兄,我怎么连个最质粒dna的提取简单的TA克隆都做不成功啊



师兄:广东快乐十分开奖结果师妹,怎么看你做克隆都做了半个月了,还没有结果吗?

我:对啊,师兄,我也不知道为什么,我鉴定老是没成功?

师兄:你真的了解TA克隆,你要是真的了解肯定早出结果了。

我:真的了解?难道还有什么秘诀吗,师兄

师兄:看你一脸懵逼的样就知道你肯定不知道,来来来,我给你讲讲。

广东快乐十分开奖结果首先,TA克隆是用于PCR 产物的克隆和测序。原理是利用Taq酶能够在PCR 产物的3’末端加上一个非模板依赖的A,而T载体是一种带有3’T突出端的载体,在连接酶作用下,可以快速地、一步到位地把PCR 产物直接插入到质粒载体的多克隆位点中。

那么在你做TA克隆时,需要准备的前期工作是什么呢?

1

设计引物P出你的目的基因

不管你是手动设计还是软件设计或是直接引用别人已经发表文章用到的引物,只要能P出来目的片段就行,在PCR的结果中需要注重P出来的浓度,要达到浓度高的要求一方面是在前期的样本准备本身就得到高浓度。

广东快乐十分开奖结果比如要P出一种病毒的某部分基因,那么在病毒的RNA提取时,就必须保证该病毒的病变效果明显,才有可能得到高浓度的RNA,继而或者逆转录得到高浓度的cDNA。

另一方面是在PCR的条件时对于退火温度等的条件把握,如果有一些引物二聚体存在,那么可以尝试提高退火温度,延长一点延伸时间,但具体如何使得PCR跑出来又亮又单一,还是需要摸摸条件。

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2

切胶回收产物

在紫外仪下切下目的产物,注意一定要快准狠,尽快切下,并尽可能少的切下多余的胶,回收利用的试剂盒一般严格按照试剂盒操作应该没有什么问题。回收之后测浓度,准备下一步。

3

连接

这一步骤就直接按照选择的T载体说明书来操作了,需要注意的是,在上一步测完回收浓度后,如果浓度较低,建议在试剂加量上尽量加大DNA的用量。

一般来说回收之后就赶紧地进行连接,但是由于有时候可能中间时间耽误了,没能及时连接,那么在这之前可以补加两个步骤,一是加A尾,二是纯化回收的产物。

广东快乐十分开奖结果但是在长期的尝试中,我发现纯化与否和手动加A尾并不怎么影响连接效果。

4

转化铺板

这个步骤用来筛选重组子,长出来的菌多不是好事,菌少也不是坏事,也许就只长两个单克隆菌,但这两个都是阳性重组子,反正只要挑到正确的就行。

5

菌液PCR鉴定

一般挑菌之后在EP管中摇个3到5个小时就可以进行菌液PCR了,一般来说这样的摇菌时间能最保证接近真实的阳性结果,菌液PCR之前有人建议说要煮沸几分钟再P,但其实直接取摇菌的1ul作为模板,进行PCR 就可以了,条件与之前P产物的条件一致。

6

酶切鉴定

广东快乐十分开奖结果酶切位点的选择必须要确保 目的基因中没有这个位点,而载体与目的基因连接附近有位点。在进行酶切的时候是要摸酶切时间的,是否已经切开跑一个电泳看看。

7

测序鉴定

广东快乐十分开奖结果如果实在是觉得上面两个鉴定都拿不准,那也可以尝试测序,如果测序结果与目的基因能够完全比对匹配上,那么也说明就是连接上了。

师兄:你看看,其实TA克隆是非常简单的克隆,先天的条件A和T都已经具备了,除非你手实在不顺,连个2500bp以下的都是没什么问题的。

我:广东快乐十分开奖结果好吧,师兄,我发现你说的注意的点我好像是有问题,我再来试试吧。




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